L’esperienza consiste nell’estrazione dei pigmenti fotosintetici presenti nelle foglie con solventi organici (distribuzione tra fasi) e successiva separazione mediante cromatografia su strato sottile (TLC). Comprende inoltre l’analisi spettrofotometrica dei pigmenti, utile alla comprensione del loro ruolo biologico. La TLC permette una migliore separazione cromatografica dei pigmenti fotosintetici rispetto alla cromatografia su carta.
Scheda sintetica delle attività
I pigmenti fotosintetici contribuiscono a realizzare la trasformazione dell’energia della luce in energia chimica necessaria alla vita della pianta. Nell'esperimento proposto si estrarranno inizialmente i pigmenti fotosintetici utilizzando foglie verdi. L'estrazione dei pigmenti (clorofille, xantofille e carotenoidi) sarà ottenuta mediante distribuzione tra fasi (metanolo/etere di petrolio) con l'ausilio di un imbuto separatore. La separazione dei pigmenti sarà ottenuta mediante cromatografia su strato sottile (lastre di alluminio ricoperte di gel di silice) utilizzando una miscela di solventi organici. I pigmenti così separati saranno estratti con acetone ed analizzati mediante spettrofotometria. Il loro spettro di assorbimento ci consentirà di comprendere meglio il loro ruolo biologico.
Risorse necessarie
Imbuto separatore;
mortaio e pestello in porcellana;
lastre cromatografiche per cromatografia su strato sottile (TLC) in alluminio ricoperto di gel di silice;
Conoscenza della struttura della foglia e dei cloroplasti;
aspetti generali della fotosintesi;
conoscenza degli aspetti teorici generali della distribuzione tra fasi.
Obiettivi di apprendimento
Obiettivi
I pigmenti fotosintetici contribuiscono a realizzare la trasformazione dell’energia della luce in energia chimica necessaria alla vita della pianta. Separarli, analizzarli, conoscere le loro proprietà di assorbimento della luce ci consente di comprendere meglio il loro ruolo biologico.
Competenze acquisibili:
Saper effettuare una separazione di composti naturali;
conoscere la localizzazione e natura chimica dei pigmenti fotosintetici;
comprenderne le caratteristiche spettroscopiche;
comprenderne il ruolo biologico.
Dotazioni di sicurezza
Rispetto normativa sicurezza dei lavoratori (Testo unico N. 81);
rispetto normativa sulla detenzione e smaltimento di metanolo e altri solventi organici infiammabili (codice agenzia dogane, armadi adeguati, servizio smaltimento);
disponibilità di cappa chimica ;
utilizzo di dispositivi di protezione individuale (camice, guanti, occhiali protettivi).
Svolgimento
Estrazione dei pigmenti fotosintetici
Pesare 15 g di foglie di parietaria (o altre specie facilmente reperibili). Tagliuzzare e porre in un mortaio. Tutte le operazioni successive saranno condotte in cappa chimica. Aggiungere metanolo (circa 25 ml), pestare con il pestello aggiungere altro metanolo e lasciare decantare per 30 min (ogni tanto tagliuzzare e pestare ancora). Separare il metanolo dalle foglie mediante filtrazione su carta da filtro in un imbuto. Eventualmente aggiungere altro metanolo alle foglie (15 ml) pestare, filtrare e riunire con il primo filtrato. Porre la soluzione metanolica in un imbuto separatore (da 250 ml). Aggiungere 25 ml di etere di petrolio (40 - 70). Dibattere e far decantare. Gettare via la fase metanolo/acqua (sottostante a quella di etere di petrolio) aprendo il rubinetto dell’imbuto separatore. Aggiungere altro metanolo ed etere di petrolio (20 e 20 ml). Dibattere, far decantare e gettare la fase metanolica. Aggiungere eccesso di acqua contenente un cucchiaio di NaCl. Dibattere, far decantare e gettare la fase acquosa. Aggiungere Na2SO4 anidro alla fase eterea raccolta in una beuta per eliminare residui di acqua e aspettare 30 min al buio. Filtrare e concentrare la fase organica mediante flusso di azoto, se disponibile, o in corrente di aria fino a circa 2 ml.
Figura 2: estrazione dei pigmenti
SEPARAZIONE DEI PIGMENTI FOTOSINTETICI MEDIANTE CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE
I pigmenti foto sintetici saranno ora separati mediante cromatografia su strato sottile su gel di silice su lastra di alluminio. Questa tecnica sfrutta il principio della distribuzione tra fasi dei pigmenti durante l’ascesa di una miscela di solventi (la fase mobile) sulla fase fissa costituita dal gel di silice idratato e la loro diversa mobilità cromatografica dovuta alla diversa affinità degli stessi per le due fasi. Depositare il concentrato con una micro pipetta o capillare di vetro (a circa 2 cm dal bordo della lastra) e porre in vasca cromatografica contenente l’opportuna quantità della miscela esano/acetone/etere etilico (rapporto volumetrico 2/1/1), ponendo a contatto della miscela l’estremità della lastrina più vicina alla macchia di concentrato. Aspettare che i pigmenti si separino lasciando arrivare il fronte della miscela all’estremità opposta della lastra (circa 30-40 minuti). Lasciar asciugare la lastra sotto cappa chimica in corrente di aria.
Figura 3: separazione cromatografica dei pigmenti
ANALISI SPETTROFOTOMETRICA DEI PIGMENTI
Grattare le singole macchie dei pigmenti così separati con una spatola e versare la polvere in una provetta di vetro contenente un opportuna quantità di acetone, agitare e lasciar depositare la silice. Eseguire uno spettro di assorbimento (lunghezza d’onda della luce incidente 400-750 nm) dopo aver filtrato l’estratto acetonico. Utilizzare acetone per il bianco. Clorofilla A e B hanno spettri di assorbimento leggermente diversi (ChlA e ChlB hanno il picco di assorbimento nel blu rispettivamente a 430 nm e 480 nm, mentre quello nel rosso rispettivamente a 650 e 680 nm) che ne giustifica il diverso colore.
In seguito all’analisi spettrofotometrica si osserva che la clorofilla B assorbe la luce con un picco nel rosso a 630 nm, la clorofilla A a 670 nm. E’ molto diverso inoltre il loro assorbimento nel blu. I carotenoidi assorbono nel blu/verde.
L’analisi dello spettro di assorbimento dei pigmenti fotosintetici rivela caratteristiche utili alla migliore comprensione del processo fotosintetico:
A) La diversificazione dello spettro di assorbimento dei pigmenti fotosintetici garantisce un più ampio range di radiazioni assorbite
B) La disposizione dei pigmenti nei complessi antenna e le loro caratteristiche di assorbimento assicurano la direzionalità del trasferimento di energia nei complessi antenna e al centro di reazione (carotenoidi ⇒ clorofilla b ⇒ clorofilla a ⇒ P680).
Note e storia
Perché le piante sono verdi?
Il colore verde delle piante è causato dalla presenza di pigmenti fotosintetici, principalmente clorofilla, nei cloroplasti delle cellule vegetali. Questi contengono anche carotenoidi di colore giallo arancio. Il colore dei singoli pigmenti è dovuto all'assorbimento di radiazioni luminose di specifiche lunghezze d’onda nell'ambito della luce visibile dovuta alla presenza nelle molecole dei pigmenti di un numero elevato di doppi legami coniugati che è associata a transizioni elettroniche di minore energia rispetto a quelle di un legame doppio singolo. Quindi i fotoni che provocano tali transizioni nei pigmenti fotosintetici hanno lunghezza d'onda più lunga, nell'ambito del visibile (E=h/λ). Nel caso della clorofilla, questo pigmento assorbe luce nel blu e nel rosso. Le foglie, che contengono alte concentrazioni di clorofilla, appaiono verdi in quanto assorbono la componente blu e rossa della luce e quindi trasmettono e riflettono luce verde. I carotenoidi assorbono luce blu. Si può evidenziare la composizione di una miscela di pigmenti mediante semplici tecniche cromatografiche che permettono di separare i diversi tipi di clorofilla, xantofille e carotenoidi.
Funzione dei pigmenti fotosintetici
La funzione della clorofilla e degli altri pigmenti fotosintetici è quella di contribuire a realizzare la trasformazione dell'energia luminosa in energia chimica necessaria per sintetizzare gli zuccheri e, indirettamente, tutti i composti organici che costituiscono la cellula vegetale e che vengono utilizzati nei processi metabolici e di sviluppo delle piante. Ciò è realizzato nel complesso processo fotosintetico a partire da composti semplici come l'anidride carbonica, che le piante prelevano dall’atmosfera, l'acqua ed i nutrienti minerali che le piante assorbono dal suolo, secondo questa reazione generale:
Luce $6CO_2 + 6H_2O \longrightarrow C_6H_{12}O_6 + 6O_2$
Il processo fotosintetico si realizza in due fasi. Nella prima, la cosiddetta fase luminosa, la luce eccita i pigmenti fotosintetici (clorofille) dei fotosistemi II e I che di conseguenza riducono (cedono elettroni a) componenti intermedi con produzione finale di NADPH. In parallelo, viene sintetizzato ATP da una ATP sintetasi in grado di utilizzare il gradiente elettrochimico di protoni che si genera nel cloroplasto durante la fase luminosa. Gli elettroni persi dalla clorofilla sono rimpiazzati da elettroni provenienti dalla fotolisi dell’acqua, che rilascia ossigeno, operata da un complesso proteico associato al fotosistema II. Nella seconda fase, denominata fase delle reazioni del carbonio, l’ATP ed il NADPH vengono utilizzati come fonte di energia ed elettroni nelle reazioni biosintetiche degli zuccheri che iniziano con la fissazione della CO2 sul ribulosio 1,5-difosfato (carbossilazione).
Regolazione della produzione dei pigmenti fotosintetici
La produzione dei pigmenti e dei componenti dell’apparato fotosintetico è un processo metabolico che viene finemente regolato nelle cellule vegetali dalla luce stessa. Ad esempio le foglie di una giovane piantina di mais cresciuta al buio, condizione questa che simula la crescita al di sotto della superficie del terreno, non mostrano presenza di clorofilla. Non appena le foglie primarie sbucheranno dal terreno, la clorofilla ed altri componenti dell’apparato fotosintetico verranno prontamente sintetizzati grazie alla percezione da parte di specifici fotorecettori ed alla trasduzione del segnale da essi scatenata. In autunno, le foglie delle caducifoglie smettono di sintetizzare clorofilla (in quanto le fredde temperature invernali non permetterebbero un efficace processo fotosintetico) ed assumono un colore che va dal giallo arancio al marrone, al rosso vivo per la permanenza degli altri pigmenti fotosintetici (carotenoidi) o a causa dell’accumulo di altri pigmenti (antocianine).
Fotosintesi ed evoluzione
Nel corso della fotosintesi, messa in atto da piante e cianobatteri, si libera ossigeno. Per cui si definisce questo processo come fotosintesi ossigenica. La fotosintesi ossigenica, si è evoluta miliardi di anni fa in batteri fotosintetici che hanno sviluppato la capacità di utilizzare l'acqua come donatore di elettroni per il processo fotosintetico, ed ha provocato nel corso dell'evoluzione uno spettacolare aumento della concentrazione di ossigeno nell'atmosfera (che nelle fasi primordiali ne era priva). Tale fenomeno è stato probabilmente il "motore" evolutivo del metabolismo aerobico che ha permesso l'evoluzione di organismi complessi ed in ultima analisi della meravigliosa biodiversità della biosfera.
