Riassunto / Abstract

L’obiettivo di questa esperienza è quello di osservare la molecola degli acidi nucleici (DNA) dopo averla separata dall’involucro nucleare e cellulare in cui è contenuta all’ interno della cellula.
Il campione biologico di partenza, da cui si estrarrà il DNA, potrebbe essere di vario tipo, noi sceglieremo il pomodoro o frutta a polpa molle tipo kiwi.

Scheda sintetica delle attività

frammentazione del materiale (es kiwi, pomodoro, cipolla) per separare il più possibile le cellule;
lisi delle cellule con detergente;
filtrazione del lisato;
precipitazione in etanolo delle molecole di DNA e osservazione macroscopica.

Risorse necessarie

Materiale occorrente per 1 gruppo costituito da 6-8 studenti

PREPARAZIONE DELLA POLTIGLIA

100 g di kiwi (1 kiwi grande);
coltello, tagliere/piatto e forchetta;
becker da 250 cc o tazza da colazione.

PREPARAZIONE DELLA SOLUZIONE DI ESTRAZIONE

100 cc di acqua distillata (in alternativa: acqua di rubinetto);
una bilancia per pesare pochi grammi (se possibile);
3 g (1 cucchiaino raso) di Cloruro di sodio (sale da cucina)
10 cc di detergente liquido per stoviglie;
una siringa da 10 cc (senza l'ago);
un becker da 250 cc o tazza da colazione;
un cilindro graduato da 100cc.

FILTRAZIONE ed EVIDENZIAMENTO del DNA

colino del diametro di circa 12 cm;
carta da filtro (carta in rotolo per lavori di cucina);
becker o tazza;
provette da 10ml e relativo porta provette;
cubetti di ghiaccio;
etanolo freddo (conservato nel freezer);
vetrini da microscopio puliti;
filo metallico terminante in un uncino;
contagocce;
colorante basico (es: Toluidina, Blu di Metilene).

Strumentazione occorrente

Frigorifero con compartimento – 20°C;
bilancia comune per pesare il sale da cucina;
bagno termostatico o in alternativa pentola con acqua calda + termometro fino a 100°C;
microscopio.

Prerequisiti necessari

Conoscenze teoriche relative al DNA:

Il DNA come materiale ereditario;
struttura del DNA;
duplicazione del DNA;
codice genetico e sintesi delle proteine;
DNA e biotecnologie.

Conoscenze-pratiche

Saper preparare soluzioni;
saper utilizzare un microscopio e preparare il materiale per l’osservazione.

Obiettivi di apprendimento

Stimolare gli studenti a realizzare esperimenti semplici che sembrano riservati a laboratori attrezzati;
acquisire consapevolezza del principi alla base di questa esperienza.

Dotazioni di sicurezza

Nessuna

Svolgimento

Introduzione

Il DNA è una lunga molecola che contiene il progetto di un determinato essere vivente, sia esso un vegetale, un animale o anche un microrganismo. Negli organismi superiori, il DNA è contenuto nel nucleo delle cellule, nei mitocondri e nei cloroplasti.
L'attività proposta può essere realizzata in casa o in un laboratorio scolastico. Sostanzialmente, la procedura si basa sul fatto che la membrana esterna delle cellule e quella del loro nucleo è composta da sostanze grasse le quali possono essere demolite usando del detersivo per piatti. Una delle prime operazioni da compiere è quella di frammentare il frutto in modo da separare il più possibile le cellule fra loro per esporle all'azione del detersivo. Poi si mescola del detersivo alla poltiglia del frutto, liberando il DNA dalle membrane che lo trattenevano. Si filtra il materiale per lasciar passare l'acido nucleico e trattenere i residui cellulari. Infine il DNA viene fatto precipitare in alcool dove diventa visibile. Il DNA così ottenuto può essere osservato al microscopio e può essere usato per successivi esperimenti di elettroforesi o di altro tipo

Preparazione della poltiglia

Una delle prime operazioni da compiere è quella di frammentare il frutto in modo da separare il più possibile le cellule fra loro per esporle all'azione della soluzione di estrazione

Mettere 100 g di kiwi (senza la buccia) su di un piatto (o tagliere) e schiacciate con una forchetta fino a trasformarla in una poltiglia (figura 1, sinistra). Potete usare anche un frullatore. In questo caso, non sminuzzate troppo a lungo il materiale;
versate la poltiglia in un becker da 250 (figura 1, destra).

Figura 1: kiwi schiacciato e versato nel becker

Preparazione della soluzione di estrazione (3% NaCl, 10% detersivo)

Versate 3 g di sale e 90 cc di acqua distillata in un becker da 100 cc (figura 2);

Figura 2: preparazione soluzione al 3% di NaCl

mescolate fino alla completa dissoluzione del sale;
con la siringa, prelevate 10 cc di detersivo liquido e aggiungetelo alla soluzione (figura 3);
mescolate per omogeneizzare la soluzione, evitando di produrre bolle.

Figura 3: aggiunta del detersivo alla soluzione al 3% di NaCl

Estrazione del DNA

Il DNA è contenuto nel nucleo delle cellule. Per liberarlo, è necessario demolire le membrane cellulari e quelle del nucleo. Poiché queste membrane sono costituite da fosfolipidi, molecole ricche di grassi, le scioglieremo usando del detersivo liquido. Useremo anche un po' di sale che ha la funzione di facilitare l'eliminazione delle proteine su cui è avvolto il DNA (gli istoni). La poltiglia verrà portata a 60°C per accelerare e favorire il processo, oltre che per disattivare certi enzimi quali la DNasi che potrebbero degradare il DNA. La permanenza a quella temperatura per lungo tempo, comincia però a degradare ugualmente il DNA frammentandolo. Questa è la ragione per cui, dopo 15 minuti, bisogna raffreddare la poltiglia.

Versate la soluzione di estrazione nel becker contenente la poltiglia;
ponete il becker a bagnomaria a 60°C per 15 minuti, (si può utilizzare un bagno termostatico oppure più semplicemente una pentola con acqua a 60°) mescolate la poltiglia in modo da distribuire la soluzione di estrazione e da uniformare la temperatura (figura 4);

Figura 4: riscaldamento a bagnomaria della miscela ottenuta aggiungendo la soluzione alla poltiglia

raffreddate la miscela immergendo il beaker in acqua e ghiaccio per 5 minuti agitando lentamente ed in continuazione (figura 5)
togliete il becker dall'acqua fredda e prepararsi per la filtrazione.

Filtrazione

Filtrare la miscela in una tazza o in un beaker . Assicurarsi che il filtrato non sia contaminato dalla schiuma presente nella parte superiore del liquido. Con questa operazione, raccogliamo un liquido ricco di DNA, separandolo dai residui cellulari e dagli altri tessuti del frutto che verranno scartati.

Mettete il colino sopra un becker/tazza; prendete un foglio di carta per filtrare, bagnatelo e sistematelo nel colino ;versate la poltiglia sul filtro, mescolate con cura per favorire la filtrazione (figura 6);
nel filtrato otterrete un liquido ricco di DNA;
distribuite il liquido in varie provette (circa 5cc per provetta). Il numero di provette per l'osservazione deve essere almeno pari al numero di studenti del gruppo.

Figura 6: filtrazione della miscela e preparazione delle provette

Precipitazione del DNA con etanolo

Gli acidi nucleici (DNA ed RNA) sono insolubili in etanolo freddo e precipitano nello strato di etanolo sovrastante il filtrato.

Versate (lentamente e con molta attenzione) lungo il bordo della provetta contenente il filtrato un ugual volume (5ml ) di etanolo freddo (o l'alcool denaturato) evitando che si mescoli con il filtrato (figura 7);

Figura 7: aggiunta di etanolo al filtrato

l'alcool è meno denso dell'acqua, quindi forma uno strato sopra la soluzione contenente il DNA;
il DNA non si dissolve nell'alcool quindi precipita all'interfaccia tra soluzione e alcool;
lasciate riposare la provetta per 5 minuti per consentire al DNA di precipitare e di raccogliersi.

All'interfaccia fra l'alcool e il sottostante filtrato dovreste ora poter osservare una sostanza bianchiccia, gelatinosa e filamentosa (figura 8), la cui quantità tende ad aumentare. Si tratta del DNA. Purtroppo, all'interno di questa piccola massa lattiginosa, vi saranno anche numerose bollicine d'aria. Ciò è dovuto al fatto che la solubilità dei gas atmosferici in un liquido freddo è maggiore di quella in un liquido caldo, così mentre l'alcool era nel congelatore ha assorbito gas che ora riscaldandosi si dilata e forma bolle.

Osservazione al microscopio ottico (facoltativo)

Si può colorare il DNA estratto per l'osservazione al microscopio

si preleva con un’ansa sottile un po’ di sostanza gelatinosa arrotolandola su se stessa, si deposita su un vetrino portaoggetti si mescola delicatamente in una goccia di acqua distillata
si colora con una goccia di blu di metilene. Questo colorante è basico quindi si lega con i substrati acidi (DNA)
Si copre il preparato con un vetrino copri-oggetto e si osserva fino a ingrandimento 100X

Non si riconoscerà la struttura a doppia elica del DNA, che non è visibile neanche al microscopio elettronico, ma si vedranno fiocchetti e filamenti colorati di blu che sono aggregati di catena di DNA.

Note e storia

Lo scopo di questa esercitazione è quello di descrivere i principi di base per l'estrazione del DNA. Il DNA che si ottiene non è puro in quanto sono presenti proteine (istoni), per eliminarle occorre usare enzimi proteolitici quali la bromelina contenuta nel succo di ananas. Tuttavia anche demolendo le proteine il DNA estratto non può essere utilizzato per successivi esperimenti di biologia molecolare (es digestione con enzimi di restrizione e successiva corsa elettroforetica.

LA SCOPERTA DEL DNA

1869: La lunga storia del DNA comincia nel lontano 1869 con il biochimico svizzero Johann Friedrich Miescher che isolò per la prima volta gli acidi nucleici.. Per i suoi studi, si servì del pus perché ricco di globuli bianchi, cellule del sangue con grandi nuclei. Dopo l’estrazione del materiale nucleare lo analizzò e scoprì che era acido e conteneva molecole ricche in azoto, fosforo e zolfo. Infine, poiché era resistente agli enzimi che demoliscono le proteine concluse che non poteva trattarsi di materiale proteico. Egli chiamò questa sostanza “ nucleina”
1919: Phoebus Levene individuò la struttura del nucleotide, composta da base azotata, zucchero e fosfato. suggerì che il DNA consistesse in un filamento di nucleotidi legati tra loro attraverso i fosfati.
1928: Frederick Griffith scoprì un fattore, in grado di trasformare pneumococchi non virulenti in pneumococchi virulenti, miscelando i resti di batteri virulenti morti con batteri avirulenti vivi. Questo sistema, pur non fornendo nessuna evidenza su quale fosse la sostanza che determinava il cambiamento, mostrava comunque che qualcosa potesse trasportare l'informazione genetica dai resti dei batteri morti a quelli vivi. Si parlò quindi di un principio trasformante in grado di modificare i batteri vivi.
1937: William Astbury presentò i primi risultati di alcuni studi di diffrazione a raggi X, che dimostrarono che il DNA ha una struttura estremamente regolare.
1944: Oswald Theodore Avery dimostrò in un celebre esperimento insieme a Colin MacLeod e Maclyn McCarty, che il DNA è il principio trasformante alla base dell’osservazione fatta da Griffith di questo fenomeno.
1953: Alfred Hershey e Martha Chase dimostrarono attraverso un altro classico esperimento, che il materiale genetico del fago T2 è effettivamente il DNA.
Nello stesso anno, attraverso ulteriori immagini da diffrazione a raggi X realizzate da Rosalind Franklin, chimica-fisica inglese, James Watson e Francis Crick presentarono sulla rivista Nature quello che è oggi accertato come il primo modello accurato della struttura del DNA, quello della doppia elica. A disegnarne il bozzetto fu Odile Speed, pittrice e moglie di Crick

Quando Watson e Crick entrarono in scena, erano stati compiuti progressi nello studio della composizione del DNA.

1951: Linus Pauling, fu il primo a scoprire la forma elicoidale come una delle impalcature di base delle proteine, e intuisce che il DNA possa contenere qualcosa di simile. 2 premi Nobel nel 1954 e nel 1962
1950: Erwin Chargaff per primo misurò accuratamente la percentuale dei quattro nucleotidi nel DNA . Scoprì che la quantità di DNA varia da un organismo all’altro ma che il numero di molecole di adenina era esattamente uguale al numero di molecole di timina, e la stessa relazione valeva per citosina e di guanina
1957: In una importante presentazione Crick propose il dogma centrale della biologia molecolare, che fissa le relazioni tra DNA, RNA e proteine.
1958: La conferma finale del meccanismo di replicazione basato sulla struttura a doppia elica fu fornita dall‘esperimento di Matthew Meselson e Franklin Sthal . Un successivo lavoro di Crick dimostrò come il codice genetico fosse basato su triplette di basi non sovrapposte, permettendo ad Har Gobind Khorana, Robert Holley e Marshall Warren Niremberg di decifrarlo..
1962:dopo la morte di Rosalind Franklin (a causa di un tumore provocato, probabilmente, dalle alte dosi di raggi X a cui si era esposta nel corso dei suoi esperimenti), Watson, Crick e Wilkins ricevettero congiuntamente il Premio Nobel per la medicina

Queste scoperte sono alla base della moderna biologia molecolare.

Bibliografia

Griffith F. The Significance of Pneumococcal Type.J Hyg (Lond),1928 27:113-59
Avery OT, Macleod CM, McCarty M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of Pneumococcal types: induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from Pneumococcus tipe III J Exp Med. 79:137-58. 1944
Watson JD and Crick FH. Molecular structure of nucleic acids; a structure fordeoxyribose nucleic acid. Nature. 171:737-8. 1953
Meselson M, Stahl FW. The replication of DNA in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 44:671-82. 1958

Autori

Casalino Mariassunta

Schede / Allegati

discoveringdna

Prove di verifica

Estrazione di DNA da cellule vegetali

Estrazione di DNA da cellule vegetali