Riassunto / Abstract

L' Enterogermina è una sospensione di spore (batteri in uno stato di vita latente ed incapaci di riprodursi) di Bacillus clausii impiegata come probiotico nella terapia di disturbi del tratto intestinale. L’ obiettivo di questa esercitazione è quello di calcolare, mediante la tecnica della conta vitale, il numero di spore (presenti nel flaconcino di enterogermina) in grado di germinare ovvero dare origine a cellule vegetative capaci di riprodursi e formare colonie su terreno nutritivo solido

Scheda sintetica delle attività

Preparazione e sterilizzazione (mediante autoclave o pentola a pressione) del terreno di coltura solido e della soluzione fisiologica necessaria per effettuare le diluizioni Allestimento di piastre con terreno solido e di provette contenenti soluzione fisiologica. Questa fase è a cura del docente che dovrà calcolare in base ai gruppi di studenti le quantità necessarie di ciascuno di questi materiali.
Diluizioni scalari in base 10 del campione da esaminare (Enterogermina in soluzione).
Piastramento delle diluizioni opportune per avere un numero di colonie facilmente contabili comprese tra 50 e 500.
Conta delle colonie presenti sulle piastre e osservazione della loro morfologia (dimensioni, colore, margine etc).
Calcolo del numero di spore in grado di germinare presenti in 1 ml del flaconcino di enterogermina. Confronto del risultato ottenuto con quello atteso e relativi commenti.

Risorse necessarie

Materiale

Flaconcino di Enterogermina (anche se è scaduta va bene ugualmente: le spore sono forme di vita molto resistenti ad agenti chimico-fisici) contenente una coltura pura di spore Bacillus clausii. In realtà è un miscuglio di spore provenienti da 4 ceppi di Bacillus clausii ciascuno resistente a diversi antibiotici;
cilindri graduati;
beute capacità 1 litro;
capsule Petri, 60 mm, sterili;
navicelle per pesate;
provette sterili monouso;
portaprovette pipette graduate sterili da 5 e 1 ml;
siringhe monouso da 1ml;
spatole sterili monouso o spatole di vetro;
propipette;
pennarelli indelebili;
acqua distillata (dal supermercato);
Luria Broth Agar (LBA) in polvere;
NaCl oppure 100 ml di soluzione fisiologica sterile (farmacia).

DPI

camice

Strumentazione

Bilancia tecnica;
autoclave o pentola a pressione;
piastra scaldante con agitazione;
becco bunsen;
termostato/ incubatore.

Aspetti pratici

Questa esercitazione presuppone la disponibilità di un incubatore a 37°C. Se l’incubatore non è disponibile, si può usare una coperta elettrica o costruirne uno artigianale inserendo una lampada a basso voltaggio dentro ad una scatola di polistirolo o di cartone. L’esperimento può comunque essere condotto a temperatura ambiente, ma i tempi di sviluppo delle colonie sono sensibilmente più lunghi. A 28°C ci vogliono 2-3 giorni per poter osservare i risultati e 3-4 ad una temperatura di 21°C. Bisogna quindi tener conto di questo aspetto nel programmare i tempi dell’esperimento.
LBA è un terreno di crescita molto ricco contenente triptone, estratto di lievito, NaCl e agar. Se non si ha la possibilità di acquistarlo si può sostituire con dadi di carne e agar-agar (si trova nei negozi di prodotti biologici e/o equo-solidali). Per preparare 1 litro di terreno solido utilizzare 4 dadi e 15 gr di agar-agar.
In alternativa alla sterilizzazione in autoclave o pentola a pressione, portare ad ebollizione più volte il materiale con un forno a microonde
Lavorare in condizioni di asepsi, per evitare contaminazione con altri presenti nell’ambiente, richiede molta attenzione ed una buona manualità. Si può iniziare l’attività simulando la modalità con cui eseguire l’esperimento oppure eseguire effettivamente un esperimento “illustrativo”. Si dovrà decidere che approccio seguire, in funzione della conoscenza degli studenti delle tecniche e della manualità da essi posseduta.

Prerequisiti necessari

Conoscenze teoriche

Struttura e funzioni della cellula procariota;
crescita batterica;
controllo della crescita batterica: metodi di sterilizzazione con agenti fisici o chimici;
spore batteriche: sporulazione e germinazione.

Conoscenze-pratiche

Preparazione di terreni di coltura e soluzioni;
preparazione di diluizioni scalari;
capacità di operare in condizioni di asepsi per evitare contaminazioni con batteri presenti nell'ambiente di lavoro.

Obiettivi di apprendimento

Acquisire consapevolezza dei principi di base della microbiologia;
comprendere la necessità mantenere le colture pure per effettuare esperimenti;
saper analizzare le caratteristiche fenotipiche / genetiche di un determinato ceppo batterico.

Dotazioni di sicurezza

Camice

Svolgimento

L’esercitazione si compone di tre fasi da eseguire in 3 giorni

FASE 1 (a cura dell’insegnante)

Preparazione delle capsule Petri contenenti terreno di coltura agarizzato

Pesare la quantità necessaria per 500 ml (indicata dalla ditta fornitrice) di terreno nutritivo ricco (es. Luria Broth Agar), versarla in una beuta da 1 litro e aggiungere 500 ml di acqua distillata. Agitare la beuta per dissolvere l’agar e porre su una piastra scaldante finchè tutto l’agar non si è solubilizzato e il contenuto della beuta appare trasparente. Sterilizzare in autoclave o in pentola a pressione. Nel frattempo preparare le piastre in cui versare il terreno agarizzato sterilizzato: con 500ml di terreno si ottengono circa 20 piastre. Se gli studenti lavorano in gruppi sono necessarie almeno 5 piastre per gruppo. Quindi per una classe di 24 studenti e gruppi di 4 studenti occorrono 20 piastre. Si consiglia comunque di preparare una quantità maggiore di piastre e quindi preparare 2 beute contenenti ciascuna 500 ml di terreno
Dopo la sterilizzazione versare il terreno ancora bollente, utilizzando un guanto da cucina, nelle piastre. Attenzione a non lasciar raffreddare troppo il terreno, altrimenti l’agar inizia a solidificare.

Le piastre devono essere preparate almeno 3 giorni prima dell’inizio dell’esperimento. Devono essere lasciate a temperatura ambiente per 2 giorni quindi conservate in frigorifero fino al momento dell’uso. In questo modo il terreno di coltura si asciuga quel tanto che basta per assorbire rapidamente la soluzione batterica che gli studenti depositano.

Preparazione della soluzione fisiologica (SF = 9 gr/litro di NaCl).

Pesare 1.8 gr di NaCl, aggiungere ad una bottiglia o beuta pirex da 500 ml contenente 200 ml di acqua distillata. Sterilizzare in autoclave o pentola a pressione.
In condizioni di asepsi ( vicino ad un becco Bunsen) distribuire 4.5 mldi SF in provette sterili. Se gli studenti lavorano in gruppo sono necessarie almeno 6 provette di SF per gruppo. Quindi per una classe di 24 studenti e gruppi di 4 occorrono almeno 36 provette di SF. Con 200ml di soluzione fisiologica (SF) si ottengono circa 44 provette da 4.5ml da utilizzare per le diluizioni del campione in esame.

Note

Utilizzare sempre beute di volume superiore (2 volte) al liquido da sterilizzare.
Le piastre contenenti il terreno solidificato vanno sempre, sia dopo la preparazione sia durante il periodo di incubazione) tenute rovesciate (coperchio in basso).
Gli studenti devono scrivere sul fondo delle piastre, dove c’e l’agar.

FASE 2 Gruppo di 4 studenti Diluizioni e determinazione della conta vitale

Nei terreni liquidi, si può osservare il tipo di intorbidamento del liquido (superficiale, diffuso, profondo), ma non si possono contare i microrganismi. Sui terreni solidi, è possibile apprezzare la crescita dei microrganismi sotto forma di colonie separate.Si definisce vitale una cellula capace di dividersi e dare progenie; il metodo per ottenere una conta vitale consiste nel determinare il numero di cellule capaci di formare colonie. Per questo motivo la conta vitale viene anche chiamata conta in piastra o conta delle colonie. Il presupposto di questo tipo di procedura è che ogni colonia, costituita da milioni di cellule, sia originata da una singola cellula vitale. Se si ritiene che un campione contenga molte migliaia di cellule batteriche per evitare una crescita confluente e la impossibilità di contare colonie singole è necessario effettuare le opportune diluizioni.

Diluizioni

In questa esercitazione il campione in esame contiene miliardi di spore, ciascuna delle quali, in seguito alla germinazione potrà replicarsi numerose volte e dare origine ad una singola colonia: quindi per effettuare la conta delle spore in grado di germinare è necessario effettuare delle diluizioni seriali in base 10. A tale scopo si diluisce la sospensione batterica (enterogermina) fino ad una diluizione di $10^{-6}$ come nello schema sottostante.

Figura 2: diluizione della sospensione batterica

Con una siringa monouso da 1ml prelevare 0.5 ml dal flaconcino di enterogermina ($2 \cdot 10^9$ spore in 5ml = $4 \cdot 10^8$ spore in 1ml) ed aggiungerli alla provetta contenente 4.5 di SF per ottenere una diluizione di $10^{-1}$. Questa prima diluizione sarebbe opportuno che venisse eseguita dal docente cosicché con lo stesso flacone di enterogermina fornisce il campione identico a tutti gli studenti. Per avere una diluizione di $10^{-2}$ occorre prendere, con pipetta monouso da 1ml, 0.5 ml di sospensione diluita a $10^{-1}$ ed aggiungerla, alla provetta contenente 4.5 di SF. Procedendo sempre in questa maniera si ottiene una diluizione a $10^{-6}$. Le diluizioni verranno effettuate da uno solo degli studenti del gruppo: è importante osservare che in ciascun passaggio è necessario agitare bene la soluzione prima di procedere ad effettuare la diluizione successiva e che sarebbe opportuno cambiare ogni volta la pipetta da 1ml

Figura 3: provette con sospensione batterica diluita

Piastramento in superficie

Un volume noto (0,1ml) della coltura opportunamente diluita viene distribuito sulla superficie di una piastra di terreno agarizzato con una spatola di vetro sterile. La spatola deve essere immersa nell’alcool denaturato, passata sulla fiamma e raffreddata per pochi secondi all’aria vicino al becco bunsen e su un lato della piastra distante dalla zona dove si è depositato la sospensione batterica in modo da non uccidere i batteri con il calore elevato. Tuttavia nel nostro caso poiché le spore sono resistenti alle alte temperature non è necessario il raffreddamento della spatola. In alternativa si possono utilizzare spatole sterili monouso E’ importante che la superficie del terreno sia piuttosto asciutta in modo che il liquido si adsorba. Solitamente si evita di usare volumi maggiori di 0,1 ml per evitare che il liquido in eccesso non si adsorba e possa provocare la fusione di colonie diverse rendendo difficile il conteggio. E’ importante che il numero di colonie che si sviluppano su una piastra non sia troppo elevato, poiché un eccessivo affollamento impedisce ad alcune cellule di formare colonie e il conteggio sarebbe quindi sottostimato. Inoltre è anche essenziale che il numero di colonie non sia troppo piccolo, altrimenti la significatività statistica del numero di cellule così calcolato sarebbe troppo bassa. La pratica corrente, che è quella statisticamente più valida, consiste nel contare le colonie solo nelle piastre che contengono un numero di colonie compreso tra 50 e 500. Considerando l’enorme numero di spore/ml contenute nell’enterogermina ($2 \cdot 10^9$ spore in $5\ ml = 4 \cdot 10^8$ spore in 1ml ) e nell’ipotesi che poste su un terreno ricco siano tutte in grado di germinare, si effettua il piastramento solo delle diluizioni $10^{-5}$ e $10^{-6}$ in doppio (una piastra per studente sul fondo della quale lo studente deve scrivere: il gruppo di appartenenza un identificativo personale (nome o cognome) la diluizione e quantità di diluizione da piastrare.

Tabella 1: distribuzione del lavoro tra gli studenti

Distribuire in modo uniforme 0.1ml della diluizione sulla superficie del terreno della piastra corrispondente come mostrato nella figura 4.

Figura 4: distribuzione della diluizione sulle piastre

Incubare le piastre fino alla comparsa delle colonie (1-2 giorni a 37°C, più giorni a temperatura ambiente). Per valutare la sterilità dei terreni ricordarsi di incubare 1 piastra senza inoculo. Tenuto conto che viene piastrato un decimo di ml il numero di colonie attese per la diluizione $10^{-6}$ sarà circa 40 e quello per la diluizione $10^{-5}$ circa 400 (figura 5).

Figura 5: valori attesi di spore per le diverse diluizioni

FASE 3 Analisi dei risultati

Dopo l’intervallo di tempo necessario contare le CFU (Unità Formanti Colonie) ovvero le colonie che si sono formate in ciascuna piastra (figura 6). La conta viene effettuata segnando con un pennarello un puntino in corrispondenza della colonia. Attenzione i puntini vanno messi sul fondo della piastra e non sul coperchio.

Predisporre una tabella per i risultati e trascrivere il numero di colonie sulle diverse piastre (tabella 2). Verificare che non siano presenti colonie nella piastra di controllo che non è stata mai aperta. Dalla conta delle colonie si risale al numero di CFU(unità formanti colonia ) /ml del campione in esame considerando la diluizione e il volume piastrato (0.1ml ):
$$N = n \frac{1}{d}\frac{1}{V}$$ con:
N= numero di spore vitali per ml nel flaconcino di enterogermina;
n= numero di colonie sulla piastra;
d= diluizione dell’inoculo in quella piastra;
V= frazione di volume utilizzato per l’inoculo (1/10 di ml se si piastra 0.1).

Tabella 2: risultati ottenuti dagli studenti

Nell’esempio riportato le CFU/ml sono $3,65 \cdot 10^8$. Tale risultato è in accordo con quanto descritto nel flaconcino di enterogermina e dimostra che più del 90% delle spore presenti nel flaconcino di enterogermina sono in grado di germinare.

Si osserva però la presenza di colonie di dimensioni differenti: tale differenza può essere attribuita al fatto che nel flaconcino sono presenti quattro diversi ceppi di Bacillus clausii che presentano una diversa velocità di crescita

Nell’esempio le colonie ottenute nelle piastre sono coerenti con le diluizioni piastrate. Tuttavia ci possono essere degli errori in alcuni punti dell' esperienza che richiedono una analisi più attenta per capire i numero di spore presenti nel campione. Se vengono individuati alcuni valori del tutto “sballati “ si possono utilizzare le conte coerenti ( ecco il motivo delle piastre in doppio e del piastramento della doppia diluizione) altrimenti non resta che ripetere l’esperimento o sperare nel risultato degli altri gruppi

Note e storia

STORIA

La Microbiologia è antica come la vita. I batteri hanno quasi la stessa età (3,5-4 miliardi di anni) del nostro pianeta (4 miliardi di anni) e sono la prima scintilla con cui la vita si è manifestata e ha avuto origine. Ma se si vuole dare alla Microbiologia una data di inizio come Scienza, allora essa è giovane: nasce nel 1857 con Louis Pasteur considerato il padre della Microbiologia.

Le origini di terreni di coltura risalgono al 19° secolo, quando la scienza della microbiologia era solo all’inizio. L’azienda Liebig Extract of Meat Company costituita nel 1865 aveva prodotto un alimento popolare noto con il nome di “estratto di carne” che si impose subito anche come terreno di coltura batterica. Gli scienziati, primo tra tutti Robert Koch, hanno cominciato ad utilizzare estratti di carne bovina in maniera stabile. Nel 1881 Koch aveva riconosciuto le difficoltà di utilizzo di terreni liquidi per l’isolamento di colture pure, e aveva trovato alternative valide nei terreni solidi. Dopo aver testato e valutato terreni di coltura come albume d’uovo coagulato, pasta di amido e addirittura una fetta di patata tagliata in modo asettico, concluse che il miglior terreno era rappresentato da un estratto di carne con aggiunta di gelatina. La risultante ”gelatina nutriente” veniva versata su lastre di vetro piane, inoculate e poste sotto una campana di vetro. Sebbene la “gelatina nutriente” fosse un progresso importante, la gelatina aveva due svantaggi principali come agente gelificante :

Si trasformava da Gel a Liquido a temperature appena superiori a 37° impedendo alle lastre di essere incubate a temperature più elevate .
Veniva idrolizzata dalla gelatinasi, un enzima prodotto dalla maggior parte dei microrganismi proteolitici.

Nel 1882 Fannie Hesse, moglie di un assistente di Koch, suggerì al marito di sostituire la gelatina con l’agar, un agente solidificante da lei utilizzato per preparare gelatine di frutta secondo una ricetta originaria dell' Indonesia. L’agar è un polisaccaride derivato da alghe rosse, che oltre ad essere un ottimo agente gelificante presenta notevoli proprietà fisiche: si scioglie quando viene riscaldato a circa 85°C e una volta raffreddato non torna allo stato di gel fino a 34– 42°C . L’ agar è anche più chiaro della gelatina e resiste alla digestione da parte degli enzimi batterici. L’uso dell’ agar permette la creazione di un mezzo che può essere inoculato a 40°C allo stato fuso raffreddato e incubato a 60 °C senza sciogliersi. L’avvento dei terreni solidi, soprattutto dopo l’introduzione dell’agar in batteriologia ha determinato una svolta nella microbiologia in quanto rispondeva ad un'esigenza molto sentita: soltanto in questo modo è infatti possibile ottenere “colture pure”, costituite da un solo tipo di batteri, presupposto irrinunciabile per lo studio dei batteri A Julius Richard Petri: si deve il merito di avere escogitato l'ideale contenitore dei terreni solidi di Koch, la capsula di Petri, da allora sempre presente, immodificata, in tutti i laboratori di microbiologia del mondo.

NOTE

Lavorare in sterilità

Nell’applicare qualsiasi tecnica microbiologica (p.es. colture batteriche e loro manipolazione), si deve evitare la contaminazione con microrganismi estranei all’esperimento. Dal momento che i microrganismi sono ubiquitari e si possono trovare quindi su polpastrelli, superfici di lavoro, ecc., bisogna porre la massima cura nell’ evitare il contatto con fonti di possibile contaminazione. Nelle fasi in cui gli studenti operano direttamente con i batteri, deve quindi essere evitato il rischio di contaminazione. In particolare essi devono evitare qualsiasi contatto con l’estremità delle pipette, il terreno delle capsule Petri, ecc. con qualsiasi superficie. Una piccola contaminazione non rovinerà certo l’esperimento ma è importante comunque che gli studenti comprendano l’importanza del concetto di sterilità, non solo per le tecniche di laboratorio ma anche dal punto di vista dell’igiene e della salute umana

Uso della pipetta, diluizioni e piastramento

Prima di operare in laboratorio, spiegare agli studenti l’uso della pipetta e la graduazione che riporta, così che imparino a prelevare 0.1 o 0,5 ml, come richiesto durante l’esperimento. L’operazione di diluizione va condotta con attenzione sia evitando contaminazioni durante il trasferimento da una provetta alla successiva sia prelevando aliquote esatte per il trasferimento. Errori nella diluizione compromettono i risultati dell’esperimento

Nell’operazione di piastramento è controproducente trasferire nelle piastre troppa sospensione di spore . Un eccesso di liquido non verrà assorbito e le cellule batteriche (spore) non si distribuiranno in modo uniforme sulla superficie. Gli studenti devono inoltre coprire la piastra col coperchio subito dopo avervi trasferito le spore e averle distribuite sulla superficie. Importante tutte le scritte sulle piastre devono essere sul fondo dove c’è l’agar e non sui coperchi inoltre le piastre vanno messe in incubazione capovolte. In questo modo si evita che il vapore condensi sulla superficie dell’agar e che le cellule diffondano.

Autori

Casalino Mariassunta

Enterogermina: miliardi di spore di Bacillus clausii da bere